1　主题内容与适用范围

　　本标准规定了出口食品中四环素族抗生素残留量的检验方法。
　　本标准适用于出口肉或肉制品中四环素族抗生素残留量检验。蛋类和水产品可参照使用。

　　2　设备和材料

　　2.1　平皿：内径为90mm,底部平整光滑,具陶瓷盖。
　　2.2　不锈钢小管(即牛津杯,简称小管)：内径6±0.1mm,外径7.8±0.1mm,高度10±0.1mm。
　　2.3　游标卡尺：测量抑菌圈直径用。
　　2.4　均质器或乳钵。
　　2.5　离心机：4000r/min。
　　2.6　恒温水浴锅。
　　2.7　恒温箱：30±0.5℃,隔层必须水平。
　　2.8　电热干烤箱: 170±1℃,器皿灭菌用。

　　3　培养基及试剂

　　3.1　培养基
　　3.1.1　菌种培养基
　　胰蛋白胨 10.0g
　　牛肉膏 　　　　　　 5.0g
　　氯化钠　　　　　　 2.5g
　　琼脂 14～16g
　　蒸馏水 1000mL
　　将各成分加热溶解于蒸馏水中,高压灭菌(121℃,15min),最终pH应为6.5±1。
　　3.1.2　检定用培养基
　　胰蛋白胨　　　　　 6.0g
　　牛肉膏　　　　　　 1.5g
　　酵母膏　　　　　　 3.0g
　　琼脂 14～16g
　　蒸馏水 1000mL
　　将各成分加热溶解于蒸馏水中,高压灭菌(121℃,15min),最终pH5.8±0.1。
　　3.2　试剂
　　3.2.1　c(KH2PO4)＝0.1mol/dm**3磷酸盐缓冲液(PH4.5):精确称取13.6g磷酸二氢钾(分析纯)溶解于蒸馏水,并定容至1000mL。高压灭菌(115℃, 30min)。置4℃冰箱中保存。
　　3.2.2　生理盐水:称取氯化钠8.5g,溶解于1000mL蒸馏水中,高压灭菌(115℃, 30min)。
　　3.2.3　标准抗生素：四环素(TC),土霉素(OTC),金霉素(CTC),从中国药品生物制品检定所购买。要密封避光,防潮保存在4℃冰箱中。
　　3.2.4　标准抗生素原液和稀释液
　　3.2.4.1　原液
　　a.　四环素原液：称取50mg左右四环素标准品,用c(HCl)＝0.1mol/dm**3盐酸稀释并定容至1000μg/mL。
　　b.　土霉素原液：称取50mg左右土霉素标准品,用c(HCl)＝0.1mol/dm**3盐酸溶解之,再用蒸馏水稀释并定容至1000μg/mL。
　　c. 金霉素原液：称取50mg左右金霉素标准品,用蒸馏水稀释并定容至1000μg/mL。　　
以上原液保存在4℃冰箱中,可使用7d。
　　3.2.4.2　稀释液
　　a. 四环素稀释液：取上述原液用c(KH2PO4)＝0.1mol/dm**3磷酸盐缓冲液稀释配制成0.025,0.050,0.100,0.200,0.400,0.800μg/mL的稀释液,为制备标准曲线的最终标准浓度溶液,0.100μg/mL的稀释液为参考浓度溶液。
　　b. 土霉素稀释液：与四环素稀释液相同。
　　c. 金霉素稀释液：取上述原液用c(KH2PO4)＝0.1mol/dm**3磷酸盐缓冲液稀释配制成0.005,0.010,0.050,0.100,0.200,0.400μg/mL的稀释液,为制备标准曲线的最终标准浓度溶液,0.100μg/mL的稀释液为参考浓度溶液。
　　以上稀释液均在使用当天配制。

　　4　样品制备

　　取肉样品约20g,剪碎,称取其中10.0g加入c(KH2PO4)＝0.1mol/dm**3磷酸盐缓冲液20.0mL,小心搅匀,放置60min,置灭菌的均质杯中(9000～10000r/min)均质2min(或置灭菌的乳钵内研磨呈乳糜状),经4000r/min离心30min,其上清液作为被检样液。

　5　菌液和检定用平板的制备

　　5.1　菌液的制备
　　5.1.1 菌种：蜡样芽孢杆菌,菌号63301,由中国药品生物制品检定所提供。
　　5.1.2　菌液的制备：将菌种移种于盛有300mL菌种用培养基的克氏瓶内,30℃培养7d,镜检芽孢数达85％以上,用25mL生理盐水洗下菌苔,置于65℃恒温水浴加热30min,经离心(2000r/min)20min,弃去上清液,再加生理盐水,经离心弃去上清液,如此重复洗涤芽孢悬液三次,再置于65℃恒温水浴中加热30min,然后用50mL生理盐水制成芽孢悬液。置4℃冰箱中可保存30d。
　　5.1.3 芽孢悬液用量的测定：在实际检定前,先试几个平板,即把不同浓度的芽孢悬液加入检定用培养基中,使0.050μg/mL浓度的标准四环素稀释液可产生12mm以上的清晰、完整的抑菌圈而获得最适宜芽孢悬液用量。一般用量为每100 mL检定用培养基内加0.5至1.0mL或芽孢计数后使1.0mL悬液含芽孢数约为10**6。
　　5.2　检定用平板的制备：将适量芽孢悬液(已于5.1.3条中确定)加到溶化后冷却至55～60℃的检定用培养基中,混匀,每个平皿内加入6 mL,前后摇动平皿,使含有芽孢的检定培养基均匀覆盖于平皿表面,置水平位置,盖上陶瓷盖,待凝固后,每个平板的培养基表面放置6个小管,使小管在半径为2.8cm的圆面上成60°角的间距。所用平板须当天制备。

　　6　检定

　　6.1　标准曲线的制备
　　标准曲线上的每个标准浓度取3个检定用平板为一组。在每个检定用平板上的其中3个小管内加满参考浓度溶液,另3 个小管内加满标准浓度溶液,参考浓度与标准浓度溶液要间隔放置,5个标准浓度共用15个检定用平板,含量最低的标准浓度 (四环素和土霉素为0.025μg/mL,金霉素为0.005μg/mL)的3个检定用平板作为产生阴性结果的平板对照,其他12个检定用平板用来绘制标准曲线,这样参考浓度0.100μg/mL的稀释液将得出45个抑菌圈直径的数值,而标准曲线上其他的标准浓度将得出9个抑菌圈直径的数值。
　　将陶瓷盖重新盖好,置30±1℃培养17±1h。然后翻转平板,除去小管,精确地测量产生的抑菌圈直径(精确到0.1mm),求出每组 3个检定用平板上0.100μg/mL浓度的抑菌圈直径读数与其他标准浓度的抑菌圈直径读数的平均值,再求出参考浓度0.100μg/mL的所有45个抑菌圈直径数值的平均值作为标准曲线的校正点,来校正其他各标准浓度的抑菌圈读数的平均值。
　　例加：参考浓度0.100μg/mL的45个抑菌圈直径数值的平均值为15.0mm,而一组3个标准浓度为0.200μg/mL检定用平板中 9个0.100μg/mL浓度抑菌圈直径数值的平均值为14.8mm, 则校正值为＋0.2mm,如 3个检定用平板中0.200μg/mL浓度抑菌圈直径数值的平均值为17.0mm,经校正后的值应为17.2mm。